NMT非损伤微测技术实验分类标准流程（SOP）
生殖发育
花粉管
花粉管NMT实验SOP
适用指标：H+、Ca2+、K+、Cl-
流速传感器规格：细胞样品专用1-2 μm（XY-CGQ-02）
物镜倍数：10-20倍
采样规则：X-10
测试液配方： 0.5 mM CaCl2，0.5 mM KCl，0.1 mM MgSO4 1.0 mM H3BO3，15% （w/v）蔗糖，0.1 mM HEPES，pH7.5
所需物品：直径35 mm培养皿、固定样品玻片（XY-BP）
实验步骤：
1实验准备：将体外萌发好的花粉管吸附在多固定样品玻片。
（1）将固定样品玻片置于35 mm培养皿底部。
（2）取体外萌发好的花粉管悬液100 μL，滴至玻片上方，均匀摊开。
（3）室温静置10分钟后，用测试液将未吸附的花粉管洗去。
（4）加入4 mL测试液，静置平衡15分钟。
2样品检测：
（1）将平衡好的花粉管样品直接上样进行检测。
（2）检测位点：花粉管的表面各个位点均可
（3）检测时长：5-10分钟/点
（4）重复数：n≥8
参考文献：
1.Meng JG, Liang L, Jia PF, Wang YC, Li HJ, Yang WC. Integration of ovular signals and exocytosis of a Ca2+ channel by MLOs in pollen tube guidance. Nat Plants. 2020 Feb;6(2):143-153. doi: 10.1038/s41477-020-0599-1. Epub 2020 Feb 13. PMID: 32055051.
2.Zhang C, Xie P, Zhang Q, Xing Y, Cao Q, Qin L, Fang K. Low Concentration of Aluminum-Stimulated Pollen Tube Growth of Apples (Malus domestica). Plants (Basel). 2022 Jun 28;11(13):1705. doi: 10.3390/plants11131705. PMID: 35807657; PMCID: PMC9269008.
3.Chen T, et al. Combined proteomic and cytological analysis of Ca2+-calmodulin regulation in Picea meyeri pollen tube growth. Plant Physiology, 2009, 149: 1111 - 1126.
保卫细胞
气孔打开过程
气孔打开过程离子/分子跨膜转运速率
适用指标：H+、Ca2+、K+、Cl-
流速传感器规格：细胞样品专用1-2 μm（XY-CGQ-02）
物镜倍数：20-40倍
采样规则：Z-10
测试液配方：10 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 1.0 mM MES, pH6.15
所需物品：直径35 mm培养皿、双面胶、软毛刷
实验步骤：
1实验准备：促气孔关闭
（1）摘取植株整片叶片，浸泡在溶液（1.0 mM MES, pH6.15）当中，避光处理30分钟，至气孔关闭。
（2）将处理好的叶片撕取下表皮备用。
（3）将撕下的下表皮一半用双面胶固定在35 mm培养皿底部，且下表皮内测面朝上。
（4）加入4 mL测试液，静置平衡10分钟。
2样品检测：
（1）将平衡好的保卫细胞样品直接上样进行检测，保持室内暗光。
（2）检测位点：气孔关闭的保卫细胞表面
（3）检测时长：5分钟/点
（4）瞬时开光并立即检测，光强≥20000勒克斯
（5）检测时长：10分钟
（6）重复数：n≥8
参考文献
1.Pei D, Hua D, Deng J, Wang Z, Song C, Wang Y, Wang Y, Qi J, Kollist H, Yang S, Guo Y, Gong Z. Phosphorylation of the plasma membrane H+-ATPase AHA2 by BAK1 is required for ABA-induced stomatal closure in Arabidopsis. Plant Cell. 2022 Apr 11:koac106.
2.Chen S, Wang X, Jia H, Li F, Ma Y, Liesche J, Liao M, Ding X, Liu C, Chen Y, Li N, Li J. Persulfidation-induced structural change in SnRK2.6 establishes intramolecular interaction between phosphorylation and persulfidation. Mol Plant. 2021 Jul 6:S1674-2052(21)00268-9.
3.Chang Y, Shi M, Sun Y, Cheng H, Ou X, Zhao Y, Zhang X, Day B, Miao C, Jiang K. Light-induced stomatal opening in Arabidopsis is negatively regulated by chloroplast-originated OPDA signaling. Curr Biol. 2023 Feb 18:S0960-9822(23)00151-3.
气孔关闭过程
气孔关闭过程离子/分子跨膜转运速率
适用指标：H+、Ca2+、K+、Cl-
流速传感器规格：细胞样品专用1-2 μm（XY-CGQ-02）
物镜倍数：20-40倍
采样规则：Z-10
测试液配方：50 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 10 mM MES, pH6.15
所需物品：直径35 mm培养皿、双面胶、软毛刷
实验步骤：
1实验准备：促气孔充分打开
（1）摘取植株整片叶片，浸泡在测试液当中，光照（光照强度20000勒克斯）照射90分钟。
（2）将处理好的叶片撕取下表皮备用。
（3）将撕下的下表皮一半用双面胶固定在35mm培养皿底部，且下表皮内测面朝上。
（4）加入4 mL测试液，静置平衡10分钟。
视频资源：
2样品检测：（以ABA为例）
（1）将平衡好的保卫细胞样品直接上样进行检测。
（2）检测位点：气孔打开较大的保卫细胞表面
（3）检测时长：5分钟/点
（4）瞬时在检测样品培养皿中加入1 mL的ABA母液（5×ABA终浓度，50 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 10 mM MES, pH6.15）
（5）检测时长：10分钟
（6）重复数：n≥8
视频资源：
参考文献
1.Pei D, Hua D, Deng J, Wang Z, Song C, Wang Y, Wang Y, Qi J, Kollist H, Yang S, Guo Y, Gong Z. Phosphorylation of the plasma membrane H+-ATPase AHA2 by BAK1 is required for ABA-induced stomatal closure in Arabidopsis. Plant Cell. 2022 Apr 11:koac106.
2.Chen S, Wang X, Jia H, Li F, Ma Y, Liesche J, Liao M, Ding X, Liu C, Chen Y, Li N, Li J. Persulfidation-induced structural change in SnRK2.6 establishes intramolecular interaction between phosphorylation and persulfidation. Mol Plant. 2021 Jul 6:S1674-2052(21)00268-9.
3.Chang Y, Shi M, Sun Y, Cheng H, Ou X, Zhao Y, Zhang X, Day B, Miao C, Jiang K. Light-induced stomatal opening in Arabidopsis is negatively regulated by chloroplast-originated OPDA signaling. Curr Biol. 2023 Feb 18:S0960-9822(23)00151-3.
当下状态
保卫细胞离子/分子跨膜转运速率
适用指标：H+、Ca2+、K+、Cl-
流速传感器规格：细胞样品专用1-2 μm（XY-CGQ-02）
物镜倍数：20-40倍
采样规则：Z-10
测试液配方：10 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 1.0 mM MES, pH6.15
所需物品：直径35 mm培养皿、双面胶、软毛刷
实验步骤：
1实验准备：促气孔关闭
（1）摘取植株整片叶片，浸泡在溶液（1.0 mM MES, pH6.15）当中，光照（光照强度20000勒克斯）照射90分钟。
（2）将处理好的叶片撕取下表皮备用。
（3）将撕下的下表皮一半用双面胶固定在35 mm培养皿底部，且下表皮内测面朝上。
（4）加入4 mL测试液，静置平衡10分钟。
2样品检测：
（1）将平衡好的保卫细胞样品直接上样进行检测。
（2）检测位点：气孔关闭的保卫细胞表面
（3）检测时长：5-10分钟/点
（6）重复数：n≥8
参考文献
1.Pei D, Hua D, Deng J, Wang Z, Song C, Wang Y, Wang Y, Qi J, Kollist H, Yang S, Guo Y, Gong Z. Phosphorylation of the plasma membrane H+-ATPase AHA2 by BAK1 is required for ABA-induced stomatal closure in Arabidopsis. Plant Cell. 2022 Apr 11:koac106.
2. Chen S, Wang X, Jia H, Li F, Ma Y, Liesche J, Liao M, Ding X, Liu C, Chen Y, Li N, Li J. Persulfidation-induced structural change in SnRK2.6 establishes intramolecular interaction between phosphorylation and persulfidation. Mol Plant. 2021 Jul 6:S1674-2052(21)00268-9.
3. Chang Y, Shi M, Sun Y, Cheng H, Ou X, Zhao Y, Zhang X, Day B, Miao C, Jiang K. Light-induced stomatal opening in Arabidopsis is negatively regulated by chloroplast-originated OPDA signaling. Curr Biol. 2023 Feb 18:S0960-9822(23)00151-3.